Хроматин: определение, строение и роль в делении клеток. Уровни компактизации ДНК

В препарате хроматина на долю ДНК приходится обычно 30-40%. Эта ДНК представляет собой двухцепочечную спиральную молекулу. ДНК хроматина обладает молекулярной массой 7-9*106. Такую сравнительно малую массу ДНК из препаратов можно объяснить механическими повреждениями ДНК в процессе выделения хроматина.

Общее количество ДНК, входящее в ядерные структуры клеток, в геном организмов, колеблется от вида к виду. Сравнивая количество ДНК на клетку у эукариотических организмов, трудно уловить какие-либо корреляции между степенью сложности организма и количеством ДНК на ядро. Примерно одинаковое количество ДНК имеют различные организмы, как лен, морской еж, окунь (1, 4-1, 9 пг) или рыба голец и бык (6, 4 и 7 пг).

У некоторых амфибий в ядрах количество ДНК больше, чем в ядрах человека, в 10-30 раз, хотя генетическая конституция человека несравненно сложнее, чем у лягушек. Следовательно, можно предполагать, что «избыточное» количество ДНК у более низко организованных организмов либо не связано с выполнением генетической роли, либо число генов повторяется то или иное число раз.

Сателлитная ДНК, или фракция ДНК с часто повторяющимися последовательностями, может участвовать в узнавании гомологичных районов хромосом при мейозе. По другим предположениям, эти участки играют роль разделителей (спейсеров) между различными функциональными единицами хромосомной ДНК.

Как оказалось, фракция умеренно повторяющихся (от 102 до 105 раз) последовательностей принадлежит к пестрому классу участков ДНК, играющих важную роль в обменных процессах. В эту фракцию входят гены рибосомных ДНК, многократно повторенные участки для синтеза всех тРНК. Более того, некоторые структурные гены, ответственные за синтез определенных белков, также могут быть многократно повторены, представлены многими копиями (гены для белков хроматина - гистонов).

Итак, ДНК эукариотических клеток гетерогенна по составу, содержит несколько классов последовательностей нуклеотидов:

Часто повторяющиеся последовательности (>106 раз), входящие во фракцию сателитной ДНК и не транскрибирующиеся;

Фракция умеренно повторяющихся последовательностей (102-105), представляющих блоки истинных генов, а также короткие последовательности, разбросанные по всему геному;

Фракция уникальных последовательностей, несущая информацию для большинства белков клетки.

ДНК прокариотического организма представляет собой одну гигантскую циклическую молекулу. ДНК эукариотических хромосом представляет собой линейные молекулы, состоящие из тандемно (друг за другом) расположенных репликонов разного размера. Средний размер репликона около 30 мкм. Тем самым в составе генома человека должно встречаться более 50 000 репликонов, участков ДНК, которые синтезируются как независимые единицы. Эти репликоны имеют начальную и терминальную точки синтеза ДНК.

Представим себе, что у эукариотических клеток каждая из хромосомных ДНК, как и у бактерий, является одним репликоном. В этом случае при скорости синтеза 0, 5 мкм в минуту (для человека) редупликация первой хромосомы с длиной ДНК около 7 см должна занять 140 000 минут, или около трех месяцев. На самом же деле благодаря полирепликонному строению молекул ДНК весь процесс занимает 7-12 ч.

Хроматин представляет собой массу генетического вещества, состоящего из ДНК и белков, которые конденсируются с образованием хромосом во время деления эукариотических . Хроматин содержится в наших клеток.

Основная функция хроматина состоит в том, чтобы сжать ДНК в компактную единицу, которая будет менее объемной и сможет войти в ядро. Хроматин состоит из комплексов небольших белков, известных как гистоны и ДНК.

Гистоны помогают организовать ДНК в структуры, называемые нуклеосомами, обеспечивая фундамент для обертывания ДНК. Нуклеосома состоит из последовательности нитей ДНК, которые обертываются вокруг набора из восьми гистонов, называемых октомерами. Нуклеосома дополнительно складывается с получением хроматинового волокна. Хроматиновые волокна свертываются и конденсируются с образованием хромосом. Хроматин позволяет осуществить ряд клеточных процессов, включая репликацию ДНК, транскрипцию, восстановление ДНК, генетическую рекомбинацию и деление клеток.

Эухроматин и гетерохроматин

Хроматин внутри клетки может быть уплотнен в различной степени в зависимости от стадии клетки в . Хроматин в ядре содержится в виде эухроматина или гетерохроматина. Во время интерфазы, клетка не делится, а подвергается периоду роста. Большая часть хроматина находится в менее компактной форме, известной как эухроматин.

ДНК подвергается воздействию эухроматина, что позволяет проводить репликацию и транскрипцию ДНК. Во время транскрипции двойная спираль ДНК разматывается и открывается, чтобы можно было скопировать , кодирующие белки. Репликация и транскрипция ДНК необходимы для того, чтобы клетка синтезировала ДНК, белки и при подготовке к делению клеток ( или ).

Небольшой процент хроматина существует как гетерохроматин во время интерфазы. Этот хроматин плотно упакован, что не позволяет проводить транскрипцию гена. Гетерохроматин окрашивается красителями в более темный цвет, чем эухроматин.

Хроматин в митозе:

Профаза

Во время профазы митоза волокна хроматина превращаются в хромосомы. Каждая реплицированная хромосома состоит из двух хроматид, соединенных в .

Метафаза

Во время метафазы хроматин становится чрезвычайно сжатым. Хромосомы выровнены на метафазной пластинке.

Анафаза

Во время анафазы парные хромосомы () отделяются и вытягиваются микротрубочками веретена деления на противоположные полюса клетки.

Телофаза

В телофазе каждая новая перемещается в свое собственное ядро. Хроматиновые волокна разматываются и становятся менее уплотненными. После цитокинеза образуются две генетически идентичные . Каждая клетка имеет одинаковое количество хромосом. Хромосомы продолжают разматывать и удлинять образующий хроматин.

Хроматин, хромосома и хроматида

У людей часто возникают проблемы с различием терминов: хроматин, хромосома и хроматида. Хотя все три структуры состоят из ДНК и находятся внутри ядра, каждый из них определяется отдельно.

Хроматин состоит из ДНК и гистонов, которые упакованы в тонкие волокна. Эти волокна хроматина не конденсируются, но могут существовать либо в компактной форме (гетерохроматин), либо менее компактной форме (эухроматин). Процессы, включая репликацию ДНК, транскрипцию и рекомбинацию, встречаются в эухроматине. При делении клеток хроматин конденсируется с образованием хромосом.

Представляют собой одноцепочечные структуры конденсированного хроматина. Во время процессов деления клеток через митоз и мейоз, хромосомы реплицируются, чтобы гарантировать, что каждая новая дочерняя клетка получает правильное количество хромосом. Дублицированная хромосома является двухцепочечной и имеет привычную форму X. Две нити идентичны и связаны в центральной области, называемой центромером.

Является одна из двух нитей реплицированных хромосом. Хроматиды, соединенные центромером, называются сестринскими хроматидами. В конце клеточного деления сестринские хроматиды отделяются от дочерних хромосом в новообразованных дочерних клетках.

В живых организмах молекулы ДНК представляют собой либо очень длинные, либо замкнутые в кольцо двуспиральные молекулы, поэтому любой процесс, связанный с передачей наследственной информации, должен наталкиваться на серьезные топологические проблемы: возникновение положительной (+) или отрицательной (-) сверхспирализации ДНК, образование катенанов или узлов.

Сверхспирализованная ДНК обладает значительным запасом энергии по сравнению с ее релаксированной формой. Следовательно, локальное расплетание двойной спирали ДНК с отрицательными сверхвитками будет приводить к сбросу напряжения сверхспирализации и поэтому энергетически выгодно. Это отчетливо проявляется в том, что отрицательная сверхспирализация заметно стимулирует переход ДНК из правой В-формы в левую Z-форму. Отрицательная сверхспирализация ДНК облегчает связывание с ней белков, раскручивающих ее двойную спираль.

Решение названных топологических проблем обеспечивают ДНК-топоизомеразы -- ферменты, изменяющие топологию ДНК (рис. 49). Топоизомеразы релаксируют сверхспирализованные молекулы ДНК, снимая их внутреннее напряжение путем внесения одно и двуцепочечных разрывов с последующим их восстановлением лигированием). По механизму действия различают ДНК-топоизомеразы двух типов -- I и II.

ДНК-топоизомеразы I -- мономерные белки, релаксируют ДНК без затраты энергии путем внесения одноцепочечных разрывов. ДНК-топоизомеразы II функционируют в виде димеров (у эукариот) и тетрамеров (у прокариот), осуществляя АТР-зависимое расщепление обеих цепей ДНК с последующим переносом цепей через разрыв и его лигированием.

Для внесения одноцепочечного разрыва в ДНК все ДНК-топоизомеразы используют остаток тирозина, который осуществляет нуклеофильную атаку фосфатной группы ДНК с образованием фосфотирозина. В результате ферменты оказываются ковалентно связанными с 5"-или З"-концами ДНК в одноцепочечном разрыве.

Топоизомеразы подтипа 1-5" связываются преимущественно с одноцепочечными участками ДНК,

осуществляя ее разрыв с образованием 5"-фосфодиэфирной связи с тирозином активного центра фермента. Через образовавшийся разрыв проходит либо одноцепочечная ДНК (снятие витка), либо двуцепочечная (образование узла или катенана). Ферменты этого типа снимают только отрицательную суперспирализацию. Характерны для прокариот.

Топоизомеразы подтипа 1-3" связываются с двуцепочечной ДНК, разрывают одну цепь с образованием З"-фосфодиэфирной связи с тирозином активного центра фермента. Через разрыв проходит вторая цепь дуплекса, уменьшая плотность суперспирализации ДНК; знак суперспирализации существенной роли не играет. Характерны для эукариот.

Топоизомеразы типа II связываются с двуцепочечной ДНК и осуществляют разрыв обеих цепей с образованием двух 5"-фосфодиэфирных связей с тирозинами активного центра. В образовавшуюся щель проходит вторая двуцепочечная ДНК, и результатом является изменение числа положительных или отрицательных супервитков на 2 (в отличие от ферментов типа I, изменяющих число супервитков на единицу за шаг).

Этот фермент способен катенировать, декатенировать и развязывать узлы интактной ДНК. Для многократного повторения цикла требуется АТР (рис. 50).

Топоизомераза II Е. coli (ДНК-гираза) относится к ферментам типа II, но не требует АТР. Она индуцирует образование отрицательных супервитков в релаксированных кольцевых ДНК. Гираза взаимодействует с ДНК таким образом, что последняя наматывается вокруг белка. При этом возникает положительная сверхспирализация в тех местах молекулы ДНК, которые связаны с белком. Затем фермент разрывает обе нити ДНК и переносит двойную нить с внутренней стороны на внешнюю, после чего скрепляет оба разрыва, превращая положительную петлю в отрицательную (рис. 51). Это особенно важно для инициации репликации, а также необходимо для ее элонгации и терминации.

ДНК-топоизомераза II является жизненно важным ферментом любого эукариотического организма. Выяснена роль ДНК-топоизомеразы в формировании высших уровней структуры хроматина, а именно, участии фермента в образовании петель хроматина во время конденсации хромосом.

Гистоны составляют большинство основных белков хроматина и находятся примерно в том же количестве, что и ДНК. По относительной доле основных аминокислот каждого типа, которую выражают отношением лизин/аргинин, сначала охарактеризовали пять типов гистонов. След этой классификации до сих пор остается в названиях гистонов. Практически у всех эукариот обнаруживают одни и те же классы гистонов. Их свойства суммированы в табл. 29.1.

Гистоны четырех классов прямо взаимодействуют с ДНК и образуют в хроматине серию частиц первого уровня организации. Консервативность типов гистонов на протяжении эволюции можно объяснить необходимостью сохранения этой важнейшей реакции. Пятый класс гистонов принимает участие во взаимодействиях между частицами. Постоянство классов гистонов позволяет предполагать, что взаимодействия типа ДНК--гистоны, гистон--гистоны и гистон--негистоновые белки могут быть в основном похожими у разных видов. Отсюда мы можем сделать заключение об общих механизмах образования как первичных частиц, так и последующих структур более сложного порядка, состоящих из серий частиц.

Гистоны первых четырех классов имеют значительное количество как кислых, так и основных аминокислот. Поэтому эти белки несут высокий заряд. Отношение основных аминокислот к кислым находится в диапазоне 1,4-2,5. Эти гистоны подразделяются на две группы.

К аргинин-богатым относятся два вида гистонов: Н3 и Н4. Они принадлежат к наиболее консервативным из всех известных белков. Аминокислотные последовательности этих белков идентичны даже у таких удаленных видов, как корова и горох. В гистонах Н3 и Н4 других видов обнаружены только редкие аминокислотные замены. Консервативность целой последовательности говорит о том, что все ее аминокислоты имеют существенное значение для выполнения функции белка. По логике вещей эта функция должна быть одинаковой у огромного большинства различных видов, что свидетельствует в пользу концепции об общей основе для структуры хроматина.

К гистонам, умеренно обогащенным лизином, относятся два белка. Их называют Н2А и Н2В (в противоположность их номенклатурному обозначению это не родственные, а независимые белки). У различных эукариот находят те же самые два типа гистонов, но у них обнаружены заметные межвидовые вариации в аминокислотной последовательности.

Пятый класс представлен гистонами, очень богатыми лизином; он состоит из нескольких достаточно близкородственных белков с перекрывающимися последовательностями аминокислот. Это гистоны H1 (в эритроцитах птиц существует вариант, названный Н5). У этих гистонов обнаружены значительные межвидовые и межтканевые вариации (у дрожжей, по-видимому, гистонов данного класса нет). Хотя эти гистоны являются самыми основными гистонами, их легко можно выделить из хроматина, полностью растворив в солевом растворе (0,5М).

Как и следует из названия, негистоны - это все другие белки хроматина. Предполагается поэтому, что они обладают большими видовыми и тканевыми различиями, хотя строгих данных о степени их разнообразия пока нет. Эти белки составляют меньшую долю от всей массы белков хроматина, чем гистоны. Кроме того, сюда относится намного большее число белков, так что любой индивидуальный белок присутствует в значительно меньшем количестве, чем любой гистон.

В класс негистоновых белков могут попасть белки, связанные с экспрессией генов, и белки, участвующие в организации структур высшего порядка. Так, в числе наиболее выдающихся негистонов можно назвать РНК-полимеразу. HMG-белки (высокомобильная группа) составляют отдельный, хорошо различимый подкласс негистонов. Основная проблема, возникающая при работе с другими негистоновыми белками - их загрязнение другими ядерными белками

Гистоны удаляют путем конкурентного замещения полианионами декстрансульфатом и гепарином.

Нуклеосомы

Если интерфазные ядра суспендировать в растворе с низкой ионной силой, они разбухнут и в местах разрывов из них высвободятся нити хроматина. На рис. 29.1 показано лизировавшее ядро, из которого вытекают нити. В некоторых местах нити хроматина состоят из плотноупакованного материала, но в тех местах, где они вытянуты, можно видеть, что они состоят из отдельных частиц. Эти частицы называют нуклеосомами. В особенно вытянутых участках видно, что индивидуальные нуклеосомы соединены тонкой нитью - это свободная двухцепочечная ДНК. Таким образом, непрерывная двухцепочечная ДНК проходит через серию частиц.

Индивидуальные нуклеосомы можно получить, обработав хроматин ферментом нуклеазой микрококков. Это эндонуклеаза, которая разрезает нить ДНК в местах соединения между нуклеосомами. Сначала освобождаются группы частиц, а потом отдельные нуклеосомы. Мономерные нуклеосомы отчетливо видны на рис. 29.2 в виде компактных частиц (настоящая форма которых похожа на диск; см. ниже). Они седиментируют примерно со скоростью 11S, что соответствует общей массе в диапазоне 250000-300000 дальтон. Отношение белок/ДНК составляет около 1,25. Димеры, тримеры и т.д. имеют соответствующие свойства при биохимическом анализе или при наблюдении под электронным микроскопом.

Мономерные нуклеосомы содержат ДНК (~ 200 п. н.), связанную с гистоновым октамером. Этот октамер содержит гистоны Н2А, Н2В, НЗ и Н4 - по две копии каждого. Иногда их называют гистоновой сердцевиной (гистоновым кором). Такие комплексы схематически изображены на рис. 29.3.

Нуклеосома - белковый комплекс, состоящий из гистонов состава .

Характеристика нуклеосомы

ДНК в B-форме перекручена на 0,25-0,35 пн на виток спирали, при этом шаг спирали 10,2 пн/виток (у В-формы в растворе - 10,5 пн/виток). Такая ДНК делает 1,75 левых оборота вокруг нуклеосомы. Комплекс не разрушается при разрушении плеч гистонов. N-концевые домены Н3 контактируют с ДНК на входе в коровую частицу и выходе из нее, Н4 связывается с внутренней частью ДНК нуклеосомы H1 - линкерный гистон и выполняет функцию связывания нуклеосом между собой, однако у дрожжей H1 не обнаружен, а его аналог Hho1p не выполняет видимой роли в сворачивании ДНК и взаимодействии нуклеосом между собой.

Любое дополнительное увеличение содержания белка зависит от присутствия небольшого количества негистоновых белков, которые связываются с нуклеосомами.

Нуклеосомную ДНК можно разделить на две части.

ДНК минимальной нуклеосомы имеет постоянную длину 146 п.н. и относительно устойчива к расщеплению нуклеазами. (Другие нуклеазы, в том числе и нуклеаза микрококков, останавливаются перед этим отрезком ДНК.)

Линкерная ДНК заключает в себе остаток повторяющейся единицы. Ее длина может варьировать in vivo от такого малого размера, как 8 п. н., до такого большого, как 114 п.н., на 1 нуклеосому.

Рассматривая модель, изображенную на рис. 29.8 в виде поперечного сечения, можно видеть, что два витка ДНК лежат близко один к другому. Это, возможно, имеет функциональное объяснение. Один виток вокруг нуклеосомы захватывает 80 п.н., так что точки, отстоящие на это расстояние в свободной двойной спирали, могут оказаться расположенными достаточно близко друг к другу на нуклеосоме. Таким образом, если ДНК-связывающий белок одновременно контактирует с двумя витками ДНК, как показано на рис. 29.9, узнаваемые им последовательности могут отстоять на двойной спирали ДНК гораздо дальше, чем величина соединяющего их участка в белке. Часто обсуждается вопрос о том, может ли стартовая точка транскрипции находиться поблизости от положения -- 80 так чтобы обе цепи одновременно контактировали с РНК-полимеразой. (Это внесло бы конкретную деталь в обобщенную модель, показанную на рис. 11.8).

Плотность упаковки отдельной нуклеосомы равна примерно 6 (так как 67 нм ДНК упакованы в частицу длиной около 11 нм). Можно упаковать серию нуклеосом достаточно плотно, чтобы сохранить это отношение. Множество работ по изучению наборов нуклеосом было выполнено на вирусе SV40.

Важным параметром в описании структуры хроматина является степень суперспирализации, которая может возникнуть на нескольких уровнях:

суперспирализация может быть результатом упаковки ДНК на нуклеосоме.

суперспирализация может быть следствием укладки нуклеосом в структуру более высокого уровня.

Состояние суперспирализации во многом может удерживаться белками (по принципу, описанному в гл. 28). Прямые измерения плотности суперспирализации позволят узнать среднее напряжение скручивания ДНК, возникающее в результате образования свободных супервитков, но таким образом нельзя обнаружить суперспирализации, которая удерживается в ходе упаковки ДНК.

Для мини-хромосомы вируса SV40 можно прямо измерить степень суперспирализации в самой нуклеосоме. Мини-хромосома может иметь свободные супервитки в гирлянде нуклеосом, а также супервитки, удерживаемые на нуклеосоме. Процедура измерения суперспирализации, обусловленная только структурой нуклеосом, показана на рис. 29.10. Сначала освобождаются свободные супервитки самой мини-хромосомы, так что гирлянда нуклеосом образует кольцо с нулевой суперспирализацией. Затем экстрагируют гистоновые октамеры. В результате этой процедуры освободившаяся ДНК свободно расправляется. Таким образом каждый супервиток, который сдерживается в мини-хромосоме, проявится в депротеинизированной ДНК как -- 1 оборот. Так можно измерить общее число супервитков в ДНК вируса SV40.

Организация нуклеосом (гистонов) и ДНК

До сих пор мы рассматривали конструкцию нуклеосомы, исходя из того, как организованы повторяющиеся единицы длины ДНК на поверхности нуклеосом.

каким образом гистоны взаимодействуют друг с другом и с ДНК. Взаимодействуют ли гистоны только в присутствии ДНК или способны независимо собираться в октамеры?

Мы еще многого не знаем о структуре индивидуальных гистонов в нуклеосоме, но уже стала проясняться их относительная локализация. Большинство данных о взаимодействиях гистонов получено при изучении способности к агрегированию и к образованию перекрестных сшивок в нуклеосоме.

Способность гистонов агрегировать друг с другом изучена хорошо. Гистоны, богатые аргинином, можно получать в виде хорошо различимого тетрамера (Н3 2 Н4 2). Гистоны, умеренно богатые лизином, образуют продукт, который менее четко охарактеризован, но который, очевидно, образует димер (Н2А * Н2В), имеющий тенденцию к дальнейшей агрегации. Одной из форм образующегося агрегата может быть тетрамер (Н2А 2 * Н2В 2). Два указанных тетрамера называют гомотипическими (название отражает то, что каждый из них содержит только гистоны, относящиеся к одному из исходных классов).

Интактные октамеры гистонов можно получить либо экстракцией хроматина, либо (с большими трудностями) путем соединения гистонов in vitro в условиях высокой концентрации соли и белка. Октамер может диссоциировать с образованием гексамера гистонов и свободного димера Н2А * Н2В. В результате отделения второго димера Н2А * Н2В образуется тетрамер Н32Н42. Все эти формы можно экстрагировать из хроматина. Исходя из этих данных, можно сделать вывод, что в нуклеосоме имеется центральное «ядро» (kernel), состоящее из тетрамера Н3 2 Н4 2 , связанного с двумя независимыми димерами Н2А * Н2В.

Перекрестные сшивки позволяют установить, какие пары гистонов лежат ближе друг к другу в нуклеосоме. (Сложность в интерпретации этих данных заключается в том, что сшивается только небольшая часть гистонов. Поэтому следует оценивать результаты с осторожностью, учитывая типичность большинства взаимодействий.) На основе полученных данных была сконструирована модель организации нуклеосомы.

Сборка нуклеосом

1 способ. обусловлен способностью тетрамера Н32Н42 организовывать ДНК в частицы, которые несколько напоминают минимальную нуклеосому (по их чувствительности к нуклеазе микрококков). При добавлении димера Н2А * Н2В эти тельца могут превращаться в минимальную нуклеосому. Именно отсюда возникла идея о том, что в структуре нуклеосомы существует «ядро» из аргинин-богатых гистонов. Возможно, такой путь используется in vivo, поскольку это согласуется с наблюдением, что гистоны НЗ и Н4 включаются в реплицирующийся хроматин, до того как в его состав входят гистоны Н2А и Н2В.

2. способ. Данные получены при использовании поперечно-сшитых гистоновых октамеров, которые не могут диссоциировать на отдельные белки, но тем не менее сохраняют способность связывать ДНК с образованием минимальной нуклеосомы. Это говорит о том, что в принципе ДНК может обвиваться вокруг предварительно сформированного октамера.

Из ооцитов Xenopus выделен белок сборки.

Это пентамер, содержащий идентичные субъединицы по 29000 дальтон.

Это белок, преобладающий в ооцитах, и локализован он в нуклеоплазме.

Антитела, полученные против этого белка, реагируют с белками нуклеоплазмы многих эукариот. Следовательно, можно предположить, что этот белок соответствует эволюционно какой-то универсальной функции, закрепленной в процессе эволюции. Он был назван нуклеоплазмином.

В присутствии нуклеоплазмина гистоны могут связываться с ДНК, образуя в физиологических условиях (низкая концентрация соли) частицы.

Однако самого по себе нуклеоплазмина недостаточно для образования нуклеосом со специфическим интервалом.

Какова функция нуклеоплазмина?

Это кислый белок, который не связывается ни со свободной ДНК, ни с интактными нуклеосомами, но при этом он связывается со всеми индивидуальными гистонами

Реакция насыщается на уровне, равном одному пентамеру нуклеоплазмина на октамер гистона.

Нуклеоплазмин, возможно, играет роль «молекулярного сопровождающего», связываясь с гистонами и передавая их ДНК более регулируемым образом, чем было бы возможно без такого конкурента. Т.е. контролирует сродство гистонов к ДНК В пользу этого предположения говорит тот факт, что кислая полиглутаминовая кислота, а также РНК могут действовать сходным образом в качестве факторов сборки.

Фейзинг. Термином "фазирование" обозначают неслучайное расположение нуклеосом относительно конкретной последовательности нуклеотидов ДНК в определенных участках генома. Позиционирование идет в том числе при помощи специальных последовательностей ДНК, которые обладают тем свойством, что они более податливы к изгибу двойной спирали ДНК в этом месте. Перед активацией гена нуклеосомы присутствуют как в вышерасположенных регуляторных последовательностях ДНК, так и в самом промоторе. Во время индукции транскрипции такого гена регуляторные факторы (TF‚ связывающиеся с ТАТАбоксом), связываясь с ДНК, прямо или косвенно вызывают разрушение нуклеосомной структуры соответствующих участков ДНК.

Существуют области, в которых нет нуклеосом. Такие области могут быть связаны с контролем экспрессии генов или же с образованием структур более высокого уровня организации хроматина.(Льюин)

Нуклеосомы при репликации и транскрипции

При электронно-микроскопическом исследовании реплицирующегося хроматина было обнаружено, что обе новообразованные фибриллы содержат нуклеосомы. Если учесть скорость синтеза ДНК эукариот (20 нм/с), то новые нуклеосомы при удвоении хромосомных фибрилл должны возникать со скоростью 3--4 с. Такая высокая скорость образования нуклеосом связана с тем, что в момент синтеза ДНК уже существует пул синтезированных гистонов всех классов, готовых войти в состав нуклеосом. Гистоновые гены, относящиеся к фракции умеренно повторяющихся последовательностей ДНК, представлены в виде множественных копий для каждого гистона. Они активируются вместе с началом синтеза ДНК, поэтому по мере продвижения репликационной вилки новые участки ДНК могут сразу взаимодействовать с новосинтезированными гистонами. Новосинтезированные гистоны и старые гистоны в составе предшествующих нуклеосом не смешиваются при образовании нуклеосом во время репликации ДНК. Вместо этого октамеры гистонов, присутствующие до репликации, остаются интактными и переходят на дочерний дуплекс ДНК, в то время как новые гистоны собираются в совершенно новые кор-частицы на свободных от нуклеосом участках ДНК. Старые и новые октамеры гистонов распределяются между дочерними дуплексами ДНК случайным образом.

Что происходит со старыми нуклеосомами в вилке репликации ДНК, до конца не ясно. Согласно одной из гипотез, каждая из нуклеосом при подходе к ней репликативной вилки как бы расщепляется на две «полунуклеосомы», а нуклеосомная ДНК разворачивается, чтобы дать пройти этот участок ДНК-полимеразе. После этого новосинтезированная цепь ДНК связывается со свободными гистонами, которые есть в избытке в ядре, и образуются новые нуклеосомы на второй цепи ДНК.

Как уже упоминалось, для активно функционирующих зон хроматина характерно деконденсированное, диффузное, состояние. На этом свойстве хроматина основан один из методов получения фракций активного хроматина, когда с помощью центрифугирования удается осадить конденсированный хроматин из гомогенатов ядер, отделив его тем самым от диффузного хроматина, обладающего высокой транскрипционной активностью. Фракции активного хроматина обладают рядом характерных свойств: повышенной чувствительностью к нуклеазам, повышенным уровнем модификации гистонов (особенно ацетилированием гистона HI), повышенным содержанием некоторых негистоновых белков.

Биохимические данные показывают, что во время транскрипции часть нуклеосомных белков остается связанной с ДНК. Нуклеосомы как частицы видны на хроматиновых фибриллах как до места отхожде-ния транскрипта, так и после него при редкой посадке РНК-полиме-разы -- фермента, вдвое большего, чем нуклеосома. При частой посадке этого фермента (например, при транскрипции рибосомных генов или генов в других активных локусах) частицы РНК-полимеразы располагаются тесно друг к другу и между ними нуклеосомы не видны (см, рис. 101). Вероятнее всего, нуклеосомные белки при прохождении РНК-полимеразы не теряют связи с ДНК, а сама ДНК в составе нуклеосомы разворачивается. Предлагаются два варианта изменения структуры нуклеосом при синтезе РНК. При одном их них нуклеосома «расщепляется» на две полунуклеосомы, а ДНК разворачивается; при другом -- нуклеосома, частично декомпактизируясь, сохраняет тетра-мер (НЗ-Н4) 2 , а два димера Н2А-Н2В временно отходят, а затем, после прохождения РНК-полимеразы, возвращаются, при этом восстанавливается исходная нуклеосома.

Второй уровень компактизации ДНК - фибрилла диаметром 30 нм

Таким образом, первый, нуклеосомный, уровень компактизации хроматина играет как регуляторную, так и структурную роль, обеспечивая плотность упаковки ДНК приблизительно в 6--7 раз.

Однако во многих электронно-микроскопических исследованиях было показано, что как в митотических хромосомах, так и в интерфазных ядрах выявляются фибриллы хроматина диаметром 30 нм (рис. 57, в и 62). Хроматиновые фибриллы такого диаметра были видны как на ультратонких срезах после фиксации глутаровым альдегидом, так и на препаратах выделенного хроматина и выделенных хромосом в растворах, содержащих хотя бы низкие концентрации двухвалентных катионов. Показано, что фибрилла хроматина диаметром 30 нм может обратимо менять свой диаметр: становится фибриллой толщиной 10 нм, если препараты хроматина перевести в деионизованную воду или в растворы, содержащие хелатон ЭДТА. В то же время даже частичная экстракция гистона Н1 переводит исходные фибриллы хроматина (30 нм) в нити диаметром 10 нм, имеющие типичный нуклеосомный уровень организации. При добавлении к ним гистона Н1 восстанавливается первоначальный диаметр фибрилл.

Все это говорило о том, что нуклеосомные цепочки хроматина каким-то специфическим образом уложены так‚ что возникает не хаотическая агрегация нуклеосом‚ а правильная нитчатая структура диаметром 30 нм.

Относительно характера упаковки нуклеосом в составе фибриллы хроматина диаметром 30 нм существуют, по крайней мере, две точки зрения. Одна из них защищает так называемый соленоидный тип укладки нуклеосом. Согласно этой модели, нить плотно упакованных нуклеосом диаметром 10 нм образует в свою очередь спиральные витки с шагом спирали около 10 нм. На один виток такой суперспирали приходится шесть нуклеосом (см. рис. 62). В результате такой упаковки возникает фибрилла спирального типа с центральной полостью, которая иногда на негативно окрашенных препаратах бывает видна как узкий «канал» в центре фибриллы. При частичном разворачивании, декомпактизации такой фибриллы и нанесении ее на подложку хорошо видно «зигзагообразное» расположение нуклеосом вдоль фибриллы. Считается, что гистон HI обеспечивает взаимодействие между соседними нуклеосомами, не только сближая и связывая их друг с другом, но и способствуя образованию кооперативной связи между нуклеосомами, благодаря чему возникает довольно плотная спираль из фибриллы диаметром 10 нм. Удаление, даже частичное, гистона HI вызывает переход фибриллы диаметром 30 нм в фибриллу диаметром 10 нм, а при полном удалении его происходит разворачивание последней в структуру типа «бусин на нити». Такой соленоидный тип упаковки ДНК приводит к плотности упаковки, равной приблизительно 40 (т.е. на каждый микрометр нити приходится 40 мкм ДНК). Эти представления получили подтверждение при анализе структуры хроматина с помощью дифракции рентгеновских лучей и нейтронов. Здесь необходимо отметить, что представление о соленоидном типе укладки получено из анализа вторично конденсированного хроматина. Вначале были получены препараты хроматина в присутствии ЭДТА или выделялись в растворах низкой ионной силы в присутствии ионов магния. Во всех этих случаях первоначально хроматин деконденсировался до уровня «бусин на нити», где отсутствует или дестабилизируется контакт между нуклеосомами.

Если же исследовать хроматин в составе ядер или в виде выделенных препаратов, но при поддержании определенной концентрации двухвалентных катионов (не ниже 1мМ), то можно видеть дискретность в составе фибрилл хроматина диаметром 30 нм: она состоит как бы из сближенных глобул того же размера -- из нуклеомеров. В зарубежной литературе такие 30-нанометровые глобулы, иди нуклеомеры, получили название сверхбусин («супербиды») (см. рис. 57, в и 62). Обнаружено, что если в условиях, когда нуклеомерная структура фибрилл хроматина сохраняется, препараты хроматина подвергнуть нук-леазной обработке, то часть хроматина растворяется. При этом в раствор выходят частицы, имеющие размер около 30 нм, с коэффициентом седиментации, равным 45S, в растворах, содержащих 1 мМ магния. Если такие выделенные нуклеомеры обработать ЭДТА, удалить ионы магния, то они разворачиваются в нуклеосомные цепочки, содержащие 6--8 нук-леосом. Таким образом, в состав одного нуклеомера входит отрезок ДНК, соответствующий 1600 парам оснований, или 8 нуклеосомам.

Компактность нуклеомера зависит от концентрации ионов магния и наличия гистона HI. Негистоновые белки в конформационных превращениях нуклеомеров не участвуют.

Итак, основная фибрилла хроматина диаметром 30 нм представляет собой линейное чередование нуклеомеров вдоль компактизованной молекулы ДНК (см. рис. 62). Вероятно, гистоны HI, находясь в центральной зоне этой крупной частицы и взаимодействуя друг с другом, поддерживают ее целостность. В пользу этого говорят данные о кооперативном связывании гистонов HI в группе по 6--8 молекул.

Противоречие между соленоидной и нуклеомерной моделями упаковки нуклеосом в составе фибрилл хроматина может быть снято, если принять модель нерегулярного соленоида: число нуклеосом на виток спирали не является строго постоянной величиной, что может привести к чередованию участков с большим или меньшим числом нуклеосом на виток.

Нуклеомерный уровень укладки хроматина обеспечивает 40-кратное уплотнение ДНК, что важно не только для достижения целей ком-пактизации гигантских молекул ДНК. Компактизация ДНК в составе фибрилл хроматина диаметром 30 нм может налагать дополнительные функциональные ограничения. Так, обнаружено, что в составе фибриллы хроматина диаметром 30 нм ДНК становится практически недоступной для взаимодействия с таким ферментом, как метилаза ДНК. Кроме того, резко падает способность хроматина связываться с РНК-полимеразой и рядом регуляторных белков. Таким образом, второй уровень компактизации ДНК может играть роль фактора, инакти-вирующего гены.

В заключение необходимо еще раз напомнить, что как нуклеосомный, так и нуклеомерный (супербидный) уровни компактизации ДНК хроматина осуществляются за счет гистоновых белков, которые участвуют не только в образовании нуклеосом, но и в их кооперативном объединении в виде фибрилл ДНП, где ДНК претерпевает дополнительную сверхспирализацию. Все остальные уровни компактизации связаны с дальнейшим характером укладки фибрилл диаметром 30 нм в новые ком-пактизационные уровни, где ведущую роль играют негистоновые белки.

1. Виды хроматина

2. Гены, спейсеры

3. Последовательность нуклеотодов в ДНК

4. Пространственная организация ДНК

1. Во время покоя между актами деления определенные участки хромосом и целые хромосомы остаются компактными. Эти участки хроматина называют гетерохроматином. Он хорошо прокрашивается.

После деления ядра хроматин разрыхляется и в таком виде называется эухроматином. Гетерохроматин в отношении транскрипции неактивен, а в отношении репликации ДНК ведет себя иначе, чем эухроматин.

Факультативный гетерохроматин бывает гетерохроматичным только временами. Он информативен, т. е. содержит гены. Когда он переходит в эухроматическое состояние, эти гены могут становиться доступными для транскрипции. Из двух гомологичных хромосом одна может быть гетерохроматической. Эта факультативная гетерохроматизация тканеспецифична и в определенных тканях не происходит.

Конститутивный гетерохроматин всегда гетерохроматичен. Он состоит из многократно повторяющихся последовательностей оснований, неинформативен (не содержит генов) и поэтому всегда неактивен в отношении транскрипции. Его можно видеть и во время деления ядер. Он встречается :

Чаще всего у центромеры;

На концах хромосом (включая сателлиты);

Вблизи организатора ядрышка;

Вблизи гена 5S-PHK.

Гетерохроматин, прежде всего факультативный, во время интерфазы может объединяться в интенсивно окрашивающийся хромоцентр, который находится в большинстве случаев у края клеточного ядра или ядрышка.

2. Каждая хромосома - это непрерывная двойная спираль ДНК, которая у высших организмов состоит более чем из 10 8 пар оснований. В хромосомах высших растений и животных каждая двойная спираль ДНК (диаметром 2 нм) имеет длину от одного до нескольких сантиметров. В результате многократного закручивания она упакована в хроматиду длиной несколько микрометров.

Вдоль этой двойной спирали линейно распределены гены, которые составляют вместе до 25% ДНК.

Ген - это функциональная единица ДНК, содержащая информацию для синтеза полипептида или РНК. Средняя длина гена -около 1000 пар оснований. Последовательность оснований в каждом гене уникальна.

Между генами находятся спейсеры - неинформативные отрезки ДНК различной длины (иногда более 20 000 пар оснований), которые имеют значение для регулирования транскрипции соседнего гена.

Транскрипируемые спейсеры купируются при транскрипции вместе с геном, и их комплементарные копии появляются в пре-и-РНК по обе стороны от копии гена. Даже внутри самого гена имеются (только у эукариот и их вирусов) неинформативные последовательности, так называемые интроны, которые тоже транскрипируются. При процессинге все копии интронов и большинство копий спейсеров вырезаются с помощью ферментов.

Нетранскрипируемые спейсеры встречаются между генами для гистонов, а также между генами для р-РНК.

Избыточные гены представлены большим числом (до 10 4 и более) идентичных копий. Это гены :

Для т-РНК;

5S-PHK и гистонов;

Для продуктов, синтезируемых в больших количествах.

Копии расположены непосредственно друг за другом и разрешены идентичными спейсерами. У морского ежа гены для гистонов Н 4 , Н 2 ь, Н 2а и Hi лежат друг за другом, и эта генная последовательность повторяется в ДНК больше 100 раз.

3. Повторяющиеся последовательности - это последовательности нуклеотидов, многократно представленные в ДНК. Умеренно повторяющиеся последовательности - последовательности длиной в среднем 300 пар нуклеотидов с 10 2 -10 4 повторениями. К ним относятся избыточные гены, а также большинство спейсеров.

Высокоповторяющиеся последовательности с 10 5 -10 6 повторениями образуют конститутивный гетерохроматин. Они всегда неинформативны. Это в основном короткие последовательности, в них обнаруживается чаще всего 7-10 и лишь редко - только 2 (например, AT) или, наоборот, свыше 300 пар нуклеотидов. Они группируются вместе, одна повторяющаяся последовательность идет непосредственно за другой. ДНК высокоповторяющегося хроматина называют "сателлит-ными ДНК" по их поведению при аналитических процедурах фракционирования. Около 75% всего хроматина не участвует в транскрипции: это высокоповторяющиеся последовательности и нетраснкрипируемые спейсеры.

4. В изолированном хроматине участки двойной спирали ДНК обвиваются вокруг молекул гистонов, так что здесь возникает суперспираль первого порядка. Комплексы ДНК с гистоном называют нуклеосомами. Они имеют форму диска или линзы и размеры около 10 Ч 10 Ч 5 нм. В одну нуклеосому входят :

8 молекул гистонов:

Центральный тетрамер из двух молекул Нз и двух Н 4 ; и отдельно по два Н 2а и Н 2 ь;

Участок ДНК (около 140 пар оснований), который образует примерно 1,25 витка спирали и прочно связан с центральным тетрамером.

Между нуклеосомами лежат участки спирали из 30-100 пар оснований без суперспиральной структуры; здесь связывается гистон Hi

В нашивном хроматине ДНК еще больше укорочена в результате малоизученной дальнейшей спирализации (суперспирали высших порядков), которая, очевидно, фиксируется благодаря гистону Hi (и некоторым негистоновым белкам). При переходе к интерфазе эухроматин разрыхляется, так как некоторые из суперспиралей более высокого порядка раскручиваются. Это происходит, вероятно, в результате конформа-ционных изменений гистонов и ослабления взаимодействий между молекулами Hi Хроматиновые структуры толщиной 10- 25 нм (основные хроматиновые нити или спирали) видны и во время интерфазы.

Транскрипционно-активный хроматин - гены, передающие свою информацию путем синтеза РНК, в результате дальнейшей деспирализации еще больше разрыхляется. По некоторым данным, в соответствующих участках спирали ДНК гистон Hi или отсутствует, или химически изменен, например фосфори-лирован.

Структура нуклеосом также изменяется или полностью разрушается (в генах для р-РНК в ядрышке). Двойная спираль в отдельных местах раскручивается. В этих процессах, по-видимому, участвуют определенные негистоновые белки, скапливающиеся в транскрипируемых участках ДНК.

Вопрос 38. Набор хромосом

/. Геном. Плоидностъ клеток

2. Политенные хромосомы

1. Весь фонд генетической информации каждого клеточного ядра - геном - распределен между некоторым постоянным числом хромосом (п). Это число специфично для каждого вида или подвида. У лошадиной аскариды оно равно 1, у кукурузы - 10, у человека - 23, у водоросли Netrium digitus - около 600. Хромосомы одного набора различаются по следующим критериям :

Величине;

Картине хромомер;

Положению перетяжек;

В зависимости от кратности набора хромосом - плоидности - клетки делятся :

На гаплоидные;

Диплоидные;

Полиплоидные.

Гаплоидными называются клетки, которые содержат одинарный набор хромосом («), например половые клетки.

Если клетки содержат двойной набор хромосом (2 П), они диплоидные, так как генетическая информация в них представлена дважды. Диплоидны почти все соматические клетки высших растений и животных. Они содержат один отцовский и один материнский набор хромосом.

В полиплоидных клетках имеется несколько наборов хромосом (4 П, 8 П, 16 П и т. д.). Эти клетки часто особенно активны в метаболическом отношении, например многие клетки печени у млекопитающих.

Гаплоидные клетки образуются из диплоидных в результате мейоза, а диплоидные из гаплоидных - в результате оплодотворения.

Полиплоидные клетки возникают из диплоидных путем эндо-митоза - преждевременно прерванного деления ядра: после полной репликации и разделения хроматид дочерние хромосомы остаются в одном клеточном ядре, вместо того чтобы распределиться между двумя ядрами. Этот процесс может повторяться многократно.

Аномалии при образовании половых клеток могут приводить к полиплоидии всего организма. При неполной репликации некоторые части генома, например гетерохроматин, не реплицируются и остаются после эндомитоза диплоидными, в отличие от других частей, которые становятся полиплоидными.

Амплификация генов - это многократная сверхрепликация, когда реплицируются только определенные гены, которые становятся полиплоидными (гены для р-РНК в ядрышке).

Хромосомы диплоидного ядра могут быть сгруппированы попарно, по две гомологичные хромосомы. Большинство из них (так называемые аутосомы) попарно идентичны. Только две половые хромосомы, определяющие пол особи, у самцов неодинаковы - это хромосомы X и Y (гетерохромосомы). Большую часть Y-хромосомы занимает конститутивный гетерохроматин. У самок имеются две Х-хромосомы. Однако у бабочек, птиц и ряда других животных дело обстоит наоборот: самцы имеют набор XX, самки - XY.

2. Политенные хромосомы (гигантские хромосомы) содержат во много раз больше ДНК, чем обычные. Они не изменяют своей формы на протяжении цикла деления и достигают длины до 0,5 мм и толщины 25 мкм. Они встречаются, например, в слюнных железах двукрылых (мух и комаров), в макронуклеусе инфузорий и в тканях завязи бобов. Чаще всего они видны в гаплоидном числе, так как гомологичные хромосомы тесно спарены. Политения возникает в результате эндорепликации. По сравнению с эндомитозом это еще более редуцированный процесс деления - после репликации хроматиды не разделяются (процесс повторяется многократно). При этом разные отрезки ДНК умножаются в различной степени :

Участки центромер - незначительно;

Большинство информативных областей - приблизительно в 1000 раз;

Некоторые - более чем в 30 000 раз.

Поэтому политенные хромосомы представляют собой пучки из бесчисленных хроматид, разделенных не полностью. Хроматиды растянуты, гомологичные хромомеры образуют темные диски, тесно расположенные вдоль хромосомы. Эти диски разделены более светлыми полосами. Вероятно, на хроматиде один диск и одна промежуточная полоса образуют помимо спейсера один ген (реже несколько генов), который, по-видимому, находится в диске. Политенные хромосомы чрезвычайно бедны гетерохроматином.

На политенных хромосомах отдельные диски временами раздуваются в пуфы (кольца Бальбиани). Там гомологичные хроматиды отделяются друг от друга, гомологичные хромомеры раздвигаются и возникает разрыхленная структура транскрипци-онно-активного хроматина. В пуфах содержится меньше гис-тона Hi, чем в дисках, вместо него здесь находится фермент РНК-полимераза (что указывает на синтез РНК). В промежуточных полосах тоже мало гистона Hi, но есть РНК-полимераза и, возможно, происходит хотя бы незначительный синтез РНК.